കൊറോണ വൈറസ് നിർണയത്തിനുപയോഗിക്കുന്ന ആർടി–പിസിആർ പരിശോധന രീതി പരിചയപ്പെടാം

ഈ കോവിഡ്കാലത്ത് ഏറ്റവും കൂടുതൽ കേട്ട സാങ്കേതിക പദങ്ങളിൽ ഒന്നാണല്ലോ ആർടി–പിസിആർ. കൊറോണ വൈറസ് നിർണയത്തിനുപയോഗിക്കുന്ന ഈ പരിശോധന രീതിയെ പരിചയപ്പെടാം.

കോവിഡ് നിർണയത്തിനുള്ള 90 ശതമാനത്തിലേറെ കൃത്യതയാർന്ന പരിശോധനാ മാർഗമാണ്. ആർടി–പിസിആർ. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പോളിമെറേസ് ചെയിൻ റിയാക്‌ഷൻ (Reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR)) എന്നതാണ് പൂർണരൂപം. ഇതെന്താണെന്ന് മനസ്സിലാക്കാൻ ആദ്യം പിസിആർ എന്താണെന്നറിയണം.

പിസിആർ 

പരിമിതമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ നിന്നു ലഭ്യമാകുന്ന ഡിഎൻഎ തന്മാത്രകളുടെ കോടിക്കണക്കിനു കോപ്പികൾ ലാബിൽ സൃഷ്ടിക്കുന്ന വിദ്യയാണ് പിസിആർ (polymerase chain reaction). 

ഡിഎൻഎക്ക് ‘വലംപിരി ചുറ്റു ഗോവണി’ പോലുള്ള ഘടനയാണെന്ന് അറിയാമല്ലോ. അതിന്റെ രണ്ട് ഇഴകൾ രൂപപ്പെട്ടിരിക്കുന്നത് ഷുഗറും ഫോസ്ഫേറ്റും കൊണ്ടാണ്. എന്നാൽ, ഇഴകൾക്കിടയിലെ പടികൾ അഡിനിൻ, തയമിൻ, ഗ്വാനിൻ, സൈറ്റോസിൻ എന്നീ 4 തരം നൈട്രജൻ ബേസുകൾ കൊണ്ടുള്ളതാണ്. 

കോശവിഭജന സമയത്ത് ഒരു കോശത്തിലെ ഡിഎൻഎ തന്മാത്രകൾ വിഭജിക്കപ്പെടാറുണ്ട്. ഒരു സിപ്പിലെ (Zip) രണ്ടു വള്ളികളും സ്ലൈഡർ ഉപയോഗിച്ചു വേർപെടുത്തുന്നതു പോലെയാണ് ഡിഎൻഎയിലെ രണ്ട് ഇഴകളും വിഭജന സമയത്ത് അകന്നു മാറുന്നത്.  അകന്നു മാറിയ ഓരോ ഇഴയെയും ഒരു അച്ച് (Template) ആയി കണക്കാക്കിക്കൊണ്ട് അതിലെ നൈട്രജൻ ബേസുകളുടെ ക്രമമനുസരിച്ച് മറുവശത്ത് ഒരു പുതിയ ഇഴ രൂപപ്പെടും. ഈ വിഭജനത്തെ സെമികൺസർവേറ്റീവ് റിപ്ലിക്കേഷൻ എന്നു വിളിക്കും.

കോശത്തിനകത്തു നടക്കുന്ന ഈ പ്രക്രിയയ്ക്ക് പുതിയ ഡിഎൻഎ നിർമിക്കാനാവശ്യമായ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുംഎൻസൈമുകളും മുത്തുകൾ കൊരുക്കാൻ സൂചി സഹായിക്കുന്നതു പോലെ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളെ കൊരുക്കാൻ സഹായിക്കുന്ന പ്രൈമർ തന്മാത്രകളും വേണം. (DNAയുടെയോ RNAയുടെയോ ചെറിയ ഒറ്റ ഇഴ തുണ്ടുകളാണ് പ്രൈമറുകൾ) ഇവയൊക്കെ ആവശ്യാനുസരണം കോശത്തിനകത്ത്  രൂപപ്പെട്ടുകൊള്ളും.

കോശത്തിൽ നടക്കുന്ന ഈ വിഭജന പ്രക്രിയ 1984ൽ അമേരിക്കൻ ജൈവ രസതന്ത്രജ്ഞനായ കാരി മുള്ളിസ് (Kary Mulliട) പരീക്ഷണശാലയിൽ നടത്തി. തെർമോ സൈക്ളർ (Thermocycler) എന്ന പിസിആർ മെഷീൻ ഉപയോഗിച്ചാണ് ലാബിൽ ഇതു സാധ്യമാക്കുന്നത്. പിസിആർ എന്ന ഈ കണ്ടെത്തലിന് 1993ൽ അദ്ദേഹത്തിനു നൊബേൽ സമ്മാനം ലഭിക്കുകയുണ്ടായി.

പിസിആറിന്റെ    3 ഘട്ടങ്ങൾ

1.ഡീനാച്വറേഷൻ(denaturation)

ഏത് ഡിഎൻഎയുടെ വർധിത വിഭജനം ആണോ ഉദ്ദേശിക്കുന്നത്, ആ ഡിഎൻഎ തന്മാത്ര തെർമോ സൈക്ലറിൽ നിക്ഷേപിച്ച് താപനില 90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനു മുകളിൽ ഉയർത്തും. ഡിഎൻഎ തന്മാത്രയുടെ 2  ഇഴകളും അവയ്ക്കിടയിലെ ഹൈഡ്രജൻ ബന്ധനം (Bond) നഷ്ടപ്പെട്ട് വേർപെടുന്നു.

2. പ്രൈമർ അനീലിങ് (Primer Annealing)

ഡിഎൻഎയുടെ ഒറ്റ ഇഴകളുടെ ചെറു കഷണങ്ങളാണ് പ്രൈമറുകൾ. ഇവ  ആദ്യഘട്ടത്തിൽ വേർപിരിഞ്ഞ ഡിഎൻഎ തന്മാത്രയിലെ ഇഴകളുടെ 3' അഗ്രങ്ങളിൽ അനുയോജ്യമായ ഭാഗങ്ങളിൽ അതിനു സമാന്തരമായി കൂടിച്ചേരണം. അതിനായി ഉപകരണത്തിലെ താപനില 50 മുതൽ 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ക്രമീകരിക്കണം.  

3.  എക്സ്റ്റൻഷൻ അഥവാ ഇലോങ്ങേഷൻ (Extension or Elongation)

ഉപകരണത്തിലെ താപനില വീണ്ടും ക്രമീകരിച്ച്, പ്രൈമർ തന്മാത്രകളുടെ അഗ്രത്തിൽ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ കൊരുക്കപ്പെട്ട് പഴയ ഇഴകൾക്ക് സമാന്തരമായി പുതിയ ഇഴകൾ രൂപപ്പെടുന്ന പ്രക്രിയയാണിത്.

 മൂല തന്മാത്രയുടെ രണ്ടായി വേർപിരിഞ്ഞ ഇഴകളെ അച്ചാക്കി മാറ്റി അതിൽ ഓരോ ഇഴയിലും പുതിയ ഇഴകൾ രൂപപ്പെട്ട്, പുതിയ രണ്ട് ഡിഎൻഎ തന്മാത്രകൾ രൂപപ്പെടുന്നതിന്റെ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങളാണ് നമ്മൾ പരിചയപ്പെട്ടത്. രണ്ടോ മൂന്നോ മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ ഇത്തരത്തിൽ 30 പ്രാവശ്യം ഈ ചാക്രിക പ്രക്രിയ ആവർത്തിച്ചാൽ പോലും വിഭജിക്കാൻ ഉദ്ദേശിച്ച തന്മാത്രയുടെ ഒരു ബില്യനിലേറെ കോപ്പികൾ സൃഷ്ടിച്ചെടുക്കാം.

ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ രോഗനിർണയത്തിനും ഫൊറൻസിക് സയൻസിലുമൊക്കെ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.  

ആർടി  പിസിആർ

കൊറോണ വൈറസ് ഒരു ആർഎൻഎ (RNA) വൈറസാണ്. ഡിഎൻഎക്കു പകരം ആർഎൻഎ എന്ന ന്യൂക്ലികാമ്ലമാണ് ഈ വൈറസിനുള്ളിലുള്ളത്. ഈ ആർഎൻഎ തന്മാത്ര വേർതിരിച്ചെടുത്ത് അതിനെ അനുബന്ധ ഘടനയുള്ള ഡിഎൻഎ ആയി രൂപാന്തരപ്പെടുത്തും.

ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ആർഎൻഎ ഉണ്ടാകുന്ന പ്രക്രിയയാണ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ. ഇവിടെ ആർഎൻഎയിൽ നിന്നു തിരിച്ച് ഡിഎൻഎ  ഉണ്ടാക്കുന്നു. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ എന്നാണതിനെ പറയുന്നത്. ഇതിനുപയോഗിക്കുന്ന രാസാഗ്നിയാണ്  (Enzyme) റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്. 

ഈ ഡിഎൻയെ പിസിആറിലൂടെ തുടർ വിഭജനം നടത്തുന്നു. അതോടൊപ്പം, കൊറോണ വൈറസിന്റേതായ നിശ്ചിത ന്യൂക്ലിയോടെഡ് ക്രമങ്ങളെ (Target sequences) തിരിച്ചറിഞ്ഞ് ജോടി ചേരാൻ കഴിയുന്നതും തിളക്കം (Fluorescence) പ്രസരിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്നതുമായ ഒറ്റ ഇഴ ഡിഎൻഎ തുണ്ടുകൾ (Taq-man probe) ചേർത്തു കൊടുക്കും. ഇത് പിസിആറിന് വിധേയമാക്കുന്ന ഡിഎൻഎയിൽ കൊറോണ വൈറസിന്റെ നിശ്ചിത ഭാഗങ്ങളുണ്ടെങ്കിൽ അതിൽ ജോടി ചേരും. പിസിആറിൽ ഡിഎൻഎ കോടാനുകോടിയായി വിഭജിക്കപ്പെടുമ്പോൾ അതിനനുസരിച്ച് വൈറസിന്റേതായ നിശ്ചിത ടാർഗറ്റ് ഡിഎൻഎ ഭാഗങ്ങൾക്കും വൻ വർധനയുണ്ടാകും. 

അതിനോടെല്ലാം പ്രതികരിക്കുന്ന പ്രോബുകളുടെ എണ്ണവും ആനുപാതികമായി കുടും. അതിൽ നിന്നെല്ലാം പ്രസരിക്കപ്പെടുന്ന Fluorescence  തോതനുസരിച്ച് വൈറസ് കൊറോണ തന്നെ എന്ന് ഉറപ്പിക്കാം. മറ്റേതെങ്കിലും വൈറസ് ആണെങ്കിൽ അതിനോട് പ്രോബ് പ്രതികരിക്കുകയില്ലല്ലോ.

ആർടിപിസിആർ വിദ്യ ഉപയോഗിച്ച് ഇന്ന് ലഭ്യമായ ഏറ്റവും കൃത്യതയാർന്ന കോവിഡ് ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നത് ഇങ്ങനെയാണ്.

English Summary : Reverse transcription polymerase chain reaction